Studii in silico și experimentale ale unor platforme genetice mobile de rezistență multiplă la antibiotice
Studii in silico și experimentale ale unor platforme genetice mobile de rezistență multiplă la antibiotice
| Raport stiintific Etapa I- 2018 |
| Raport de activitate |
| Raport final de activitate |
(RO) RAPORT FINAL DE ACTIVITATE
RAPORT FINAL DE ACTIVITATE
Obiectivul general al proiectului este studiul evoluției locale a rezistenței la antibiotice (AR) la izolate clinice și din rețeaua de apă uzată de bacili Gram-negativi, multirezistente la antibiotice (MDR), prin studiul suportului genetic al AR și al transferabilității genelor de rezistență la antibiotice (ARG) prin intermediul elementelor genice mobile (MGE), pentru o mai bună cunoaștere a epidemiologiei moleculare a AR în România (diferențierea clonelor AR emergente local de cele regionale / globale) și îmbunătățirea managementului local al AR.
Toate obiectivele și activitățile propuse au fost îndeplinite.
Astfel, în cadrul acestui proiect, au fost analizate 101 de tulpini bacteriene Gram-negative cu fenotip MDR (respectiv 83 tulpini de Klebsiella pneumoniae, 12 tulpini de Acinetobacter baumannii, 3 tulpini de Escherichia coli, 1 tulpină de Serratia sp., 1 tulpină de Enterobacter kobei și 1 tulpină de Providencia sp.). A fost investigată prin experimente de PCR simplex și multiplex prezența genelor de rezistență la carbapeneme, dar și a genelor de AR ce conferă fenotip BLSE. Experimentele PCR la tulpinile de Enterobacteriaceae au evidențiat prezența în ordine descrescătoare a genelor blaSHV, blaNDM-1, blaOXA-48, blaTEM si blaKPC. În ceea ce privește tulpinile de A. baumannii experimentele PCR au evidentiat prezenta genei blaoxa-51 la toate tulpinile analizate, urmată de blaOXA-23,blaSHV, blaVEB, blaTEM, blaNDM-1 si blaVIM.
Investigarea transferabilității AR s-a realizat prin experimente de conjugare realizate atât în mediu lichid (Liquid mating), cât și pe mediu solid (Filter mating). Selecția transconjuganților s-a realizat pe mediu MacConkey suplimentat cu azida de sodiu (150µg/ml) și imipenem (1 µg/ml), cat si pe mediu BHI (Brain heart infusion) suplimentat cu azidă de sodiu (150µg/ml) și imipenem (1 µg/ml). În cazul tulpinilor de A. baumannii, selecția s-a efectuat pe mediu BHI suplimentat cu rifampicină (250mg/l) și meropenem (1 µg/ml) ca agenți de selecție. Majoritatea tulpinilor de Enterobacteriaceae și trei dintre tulpinile de A. baumannii incluse în experimentele de conjugare s-au dovedit a fi tulpini conjugative, cea mai mare parte a lor conjugând cu precadere pe mediu solid (filtru). Rezultatele PCR obținute pentru transconjuganți au evidențiat transferul unora dintre genele care conferă rezistența la antibioticele β-lactamice, în cazul uneia dintre tulpinile de K. pnumoniae fiind evidențiate trei gene transferate simultan, ceea ce sugerează localizarea acelor gene în aceleași elemente genetice mobile și posibilitatea diseminării acestora pe orizontală.
În a doua etapă a proiectului s-a realizat secvențierea unor gene de rezistență sau genomuri bacteriene de K. pneumoniae, A. baumannii, E. coli și E. kobei și analiza bioinformatică, atât a datelor de secvențiere obținute, cât și a conformației și interacțiunii proteinelor codificatoare pentru ARGs. S-a realizat secvențierea Next Generation Sequencing - pair-end whole genome sequencing – MiSeq System Sequencer, Illumina, iar analiza bioinformatică a produșilor de secvențiere (cu ajutorul software-urilor de asamblare și adnotare SPAdes, CARD, BLAST, ISFinder, PlasmidFinder, ResFinder, VirulenceFinder, INTEGRALL) în ceea ce priveste prezența ARGs a demonstrat faptul că tulpinile luate în studiu au prezentat gene de rezistență pentru un număr ridicat de clase de antibiotice (între 4 și 8 clase). În ceea ce privește prezența plasmidelor asociate cu AR pentru tulpinile de Enterobacteriaceae selectate, a fost evidențiată prezența a opt tipuri de plasmide, respectiv ColE10, IncA/C2, IncFIB(K), IncFII(Yp), IncHI1A(CIT), IncHI1B(CIT), IncP6, IncX1 la o tulpină de E. coli, cinci Col440II, ColRNAI, IncFII(K), IncFII(Yp), IncR și respectiv trei tipuri, ColpVC, IncFII(Yp), IncL/M (pOXA-48) de plasmide la tulpini de K. pneumoniae. Cele 3 tulpini de Enterobacteriaceae secvențiate prin NGS au aparținut clonelor ST101 si respectiv ST383 (tulpinile de K. pneumoniae) și ST 378 (tulpina de E. coli).
Studiile conformaționale au indicat conformații ale proteinelor OXA-23 și SHV-2 codificate de alelele identificate în urma analizei datelor de secvenâiere la tulpinile circulante, identice cu cele existente în bazele de date internaționale.
Colaborarea cu China (vizite științifice, organizarea de ateliere internaționale) a contribuit esențial la dezvoltarea resursei umane, oferind oportunitatea specializării tinerilor membri ai echipei din România în tehnica Next Generation Sequencing –MiSeq System Sequencer, Illumina și în analiza bioinformatică a datelor de secvențiere; această expertiză va putea fi aplicată imediat în alte două proiecte de cercetare internaționale și unul național în curs de desfășurare, contribuing esențial la obținerea unor rezultate valoroase, prin utilizarea unei metodologii de ultimă oră.
Cunoașterea epidemiologiei moleculare a AR tulpinilor de BGN circulante în România atât în sectorul clinic, cât și în mediul acvatic (diferențierea clonelor AR emergente local de cele regionale / globale) va contribui la îmbunătățirea managementului local al AR.
Rezultatele obținute în cadrul acestui proiect sunt promițătoare și vor face obiectul a cel puțin două publicații majore (una dintre acestea axată pe tulpinile MDR de Klebsiella sp., ia a doua pe cele de A. baumannii) și a trei rezumate care vor fi trimise la 30th European Congress of Clinical Microbiology & Infectious Diseases (ECCMID), Paris, Franța, 18-20 Aprilie 2020.
INDICATORI FINALI AI PROIECTULUI
În cadrul acestei vizite a echipei chineze la Institutul de Cercetări al Universității din București s-au stabilit protocoalele de urmat în cadrul proiectului și de asemenea au fost selectate tulpinile de analizat. De asemenea, s-a realizat instruirea echipei române de către partenerii chinezi cu privire la realizarea experimentelor de conjugare bacteriană și selectare a transconjuganților, dar și în ceea ce privește analiza bioinformatică a datelor, respectiv asamblarea și adnotarea primară și detaliată a genomurilor bacteriene și compararea acestora.
În cadrul acestei vizite au fost realizate experimente de conjugare bacteriană, selectare a transconjuganților și analiză a acestora, secvențierea unor genomuri bacteriene de interes și analiza bioinformatică a datelor.
Echipa română (.C. Ilda Barbu, CS Marius Surleac, drd. Laura Ioana Popa, lect dr. Irina Gheorghe) a participat la un workshop organizat de instituția gazdă (Universitatea Sichuan, prof. dr. Zong Zhiyong) referitor la bioinformatica asamblării și adnotării de genomuri bacteriene.
Articole ISI
Articole (BDI)
Participări la conferințe internationale
FINAL REPORT
The general objective of the project is the investigation of local evolution of antibiotic resistance (AR) in multidrug-resistant (MDR) Gram-negative clinical isolates and from the wastewater network, by studying the genetic support of AR and the transferability of antibiotic resistance genes (ARGs) through mobile genetic elements (MGE), for a better understanding of the molecular epidemiology of AR in Romania (differentiation of locally emerging AR clones from regional / global ones) and the improvement of local management of AR. Scientific and technical description of the results and the degree of achievement of the objectives
All proposed objectives and activities have been fulfilled.
Within this project, there were analyzed 101 Gram-negative bacterial strains exhibiting the MDR phenotype (83 strains of Klebsiella pneumoniae, 12 Acinetobacter baumannii, 3 Escherichia coli, 1 Serratia sp., 1 Enterobacter kobei and 1 Providencia sp.). The presence of carbapenem resistance genes as well as AR genes conferring ESBL phenotypes were investigated by simplex and multiplex PCR experiments.
PCR experiments in Enterobacteriaceae isolates have shown the presence in decreasing order of the blaSHV, blaNDM-1, blaOXA-48, blaTEM and blaKPC genes. Regarding A. baumannii strains PCR experiments have shown the presence of the blaOXA-51 gene in all analyzed strains, followed by blaOXA-23,blaSHV, blaVEB, blaTEM, blaNDM-1 and blaVIM.
The study of the AR transferability was performed by conjugation experiments carried out both in liquid medium (Liquid mating) and solid medium (Filter mating), for >35 selected strains. The selection of transconjugants for Enterobacteriaceae was performed on both MacConkey medium supplemented with sodium azide (150 μg/ml) and imipenem (1 μg/ml), as selection agents and on BHI medium (Brain heart infusion) supplemented with sodium azide (150 μg/ml) and imipenem (1 μg/ml). In the case of A. baumannii strains, the selection was carried out on BHI medium supplemented with rifampicin (250 mg/l) and meropenem (1 µg/ml). Most of the Enterobacteriaceae strains strains included in the conjugation experiments and three of A. baumannii strains were found to be conjugative, most of them conjugating mainly on solid medium (filter). The PCR results obtained for the transconjugants have shown the transfer of some of the genes conferring β-lactam resistance, in the case of one K. pneumoniae, three genes being transferred simultaneously, suggesting the location of those genes in the same MGEs and the possibility of horizontal dissemination.
The second phase of the project was dedicated to the sequencing of ARGs or bacterial genomes belonging to K. pneumoniae, A. baumannii, E. coli and E. kobei and the bioinformatics analysis, both of the sequencing data obtained, as well as of the conformation and interaction of the proteins encoded by the ARGs. Next Generation Sequencing - pair-end whole genome sequencing - MiSeq System Sequencer, Illumina followed by the bioinformatics analysis of sequencing products (using SPAdes, CARD, BLAST, ISFinder, PlasmidFinder, ResFinder, VirulenceFinder, INTEGRALL softwares) regarding the presence of ARGs have demonstrated that the analyzed strains harbored a high number of ARGs of antibiotic classes (between 4 and 8 classes). Regarding the presence of plasmids associated with AR for selected Enterobacteriaceae strains there have been revealed the presence of eight types of plasmids, namely ColE10, IncA/C2, IncFIB (K), IncFII (Yp), IncHI1A (CIT), IncHI1B (CIT) ), IncP6, IncX1 in one E. coli strain, five Col440II, ColRNAI, IncFII (K), IncFII (Yp), IncR and three types, ColpVC, IncFII (Yp), IncL/M (pOXA-48) plasmids respectively in K. pneumoniae strains. The three Enterobacteriaceae strains sequenced by NGS belonged to ST101 and ST383 clones (K. pneumoniae strains) and ST 378 (E. coli strain).
The conformational studies indicated conformations that the proteins OXA-23 and SHV-2 encoded by the ARG alleles identified by sequencing in the bacterial strains circulating in Romania were identical to those existing in the international databases.
The collaboration with China (scientific visits, organization of international workshops) has essentially contributed to the development of human resources, offering the opportunity for the speecialization of Romanian team young members in Next Generation Sequencing - pair-end whole genome sequencing - MiSeq System Sequencer, Illumina and the bioinformatic analysis of sequencing products; this knowledge will be immediately apllied in other two international and one national ongoing research projects, granting the achievement of valuable results using state of the art methodology.
Knowledge of the molecular epidemiology of AR in circulating Gram negative bacilli in Romania both in the clinical sector and in the aquatic environment (differentiation of locally emerging AR clones from regional / global ones) may have a major impact on improving the local management of AR.
The obtained results are promising and will feature at least two major publications (one on Klebsiella ap. and one on A. baumannii strains) and three abstract that will be 3 abstracts will be submitted to the 30th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Paris, France, 18-20 April 2020.
The visit of the Chinese team (project manager: Wang Xiaohui, team members: Zong Zhiyong, Feng Yu, Liu Lina) in Romania: 31.05-11.06.2019
During the visit of the Chinese team at the Research Institute of the University of Bucharest (ICUB) there established the protocols to be followed within the project and also were selected the strains to be analyzed. Also, was carried out the training of the Romanian team by the Chinese partners regarding the conjugation experiments and selection of the transconjugants, but also on the bioinformatics analysis of the obtained data, respectively the assembly and the annotation and the detailed annotation of the bacterial genomes and their comparison.
The visit of the Romanian team (Research Assistant Ilda Barbu, Scientific Researcher Marius Surleac, PhD Laura Ioana Popa, PhD lecturer Irina Gheorghe) in China - Chengdu: 15-28.09.2019
During this visit, there were performed the bacterial conjugation experiments, selection of transconjugants and their analysis, sequencing of the selected bacterial genomes and bioinformatic data analysis.
The Romanian team (Research Assistant Ilda Barbu, Scientific Researcher Marius Surleac, PhD Laura Ioana Popa, PhD Irina Gheorghe) participated in a workshop organized by the host institution (Sichuan University, prof. Dr. Zong Zhiyong) regarding the bioinformatics of the bacterial genomes assembly and annotation.
ISI papers
BDI papers
International Conferences
Formulări topice multifuncționale inovatoare, bioactive ...
Rezistența la antibiotice în apele uzate: riscuri de tr ...
Transferul cunoaşterii privind investigarea proprietăţi ...
Metodă rapidă bazată pe citometria în flux pentru detec ...
